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產(chǎn)品中心分子生物學(xué)試劑反轉(zhuǎn)錄相關(guān)T0126T7 High Yield RNA Synthesis Kit
產(chǎn)品簡介
product
產(chǎn)品分類| 品牌 | LABLEAD | 貨號 | T0126 |
|---|---|---|---|
| 供貨周期 | 一周 |
T7 High Yield RNA Synthesis Kit
產(chǎn)品貨號 ：T0126
儲存條件： -20℃ 保存，有效期2年
產(chǎn)品描述
組分 | 規(guī)格 (50 rxns) |
T7 Enzyme Mix | 100 μl |
10× T7 Transcription Bu?er | 100 μl |
ATP (100mM) | 100 μl |
UTP (100mM) | 100 μl |
GTP (100mM) | 100 μl |
CTP (100mM) | 100 μl |
Control Template (0.5μg/μl) | 10 μl |
DNase I, RNase-free (1U/μl) | 100 μl |
Nuclease-Free Water | 1 ml |
產(chǎn)品簡介
T7 High Yield RNA Synthesis Kit是一種使用T7 RNA聚合酶，以帶有T7啟動子的DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄大量合成RNA的試劑盒，適用于長鏈和短鏈轉(zhuǎn)錄本。本品提供的T7 Enzyme Mix中已經(jīng)預(yù)混了RNase抑制劑與無機焦磷酸酶，而DNase I，RNase-free用于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后清除模板DNA。使用本品以1μg線性化雙鏈DNA模板可以轉(zhuǎn)錄獲得至少150μg以上的RNA。通過轉(zhuǎn)錄合成的RNA可用于多種下游應(yīng)用，如體外翻譯、RNA結(jié)構(gòu)和功能研究、RNase保護、探針雜交、RNA干擾等。
轉(zhuǎn)錄方案
使用方法
1. DNA 模板制備
帶有 T7 啟動子的線性化質(zhì)粒或 PCR 擴增產(chǎn)物都可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板，模板可以用TE緩沖液或Nuclease-Free Water溶解。
T7啟動子序列：TAATACGACTCACTATAN*
注：N*為RNA轉(zhuǎn)錄的第一個堿基,一般為G，若進行共轉(zhuǎn)錄由帽子類似物決定。
（1）質(zhì)粒模板
將目的DNA插入含有T7啟動子的質(zhì)粒載體中，然后用限制酶進行處理，待完quan線性化后進行純化。
注1：由于終止子不能保證轉(zhuǎn)錄100%終止，環(huán)狀質(zhì)粒會轉(zhuǎn)錄出不同長度的RNA產(chǎn)物。為了得到特定長度的RNA，質(zhì)粒必須完quan線性化。
注2：質(zhì)粒線性化所選限制酶的酶切位點需要緊鄰編碼鏈下游，且在編碼鏈中無識別位點。選擇的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。
注3：為了避免蛋白及鹽離子等對轉(zhuǎn)錄體系的影響，線性化質(zhì)粒建議純化后再作為模板進行體外轉(zhuǎn)錄。
注4：質(zhì)粒DNA抽提過程中引入的RNaseA殘留會顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量，建議使用A260/A280為1.8~2.0的高純度RNase-free模板。
（2）PCR 產(chǎn)物模板
帶 T7 啟動子的 PCR 產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板。首先將 T7 啟動 子序列加在編碼鏈上游引物的 5' 端，然后在高保真酶的作用下擴增含 T7 啟動子的 DNA模板，隨后進行轉(zhuǎn)錄。 PCR 產(chǎn)物可以不經(jīng)純化直接作為模板， 但純化后 RNA 收率會更高。
注 1：PCR 產(chǎn)物作為模板，必須電泳確認產(chǎn)物的特異性及濃度，建議 20 μl 反應(yīng)體系投入 2~5 μl PCR 產(chǎn)物。
注 2：為了得到更多高品質(zhì)的 RNA，推薦 PCR 產(chǎn)物純化之后再作為模板進行體外轉(zhuǎn)錄。
2. 體外轉(zhuǎn)錄
（1）根據(jù)所需產(chǎn)物類型選擇下面三個反應(yīng)體系進行反應(yīng)溶液加樣。
①標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄體系
在冰上配制如下反應(yīng)體系：
試劑 | 體積 | 終濃度 |
10× T7 Transcription Bu?er | 2 μl | 1× |
T7 Enzyme Mix | 2 μl | - |
Template DNA | 1 μg | 50 ng/μl
|
ATP/CTP/GTP/UTP(100mM each)a,b | 2 μl each | 10 mM each
|
Nuclease-Free Water | up to 20 μl | - |
a. 建議先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入 ATP/CTP/GTP/UTP。
b. 可以用同樣摩爾濃度的修飾 NTP 替代相應(yīng)的未修飾 NTP。
②加帽 RNA 共轉(zhuǎn)錄體系
在冰上配制如下反應(yīng)體系：
試劑 | 體積 | 終濃度 |
10× T7 Transcription Bu?er | 2 μl | 1× |
T7 Enzyme Mix | 2 μl | - |
Template DNA | 1 μg | 50 ng/μl |
ATP/CTP/GTP/UTP (100mM each) Cap1 Analogue (100 mM)c Nuclease-Free Water | 2μl each 1.6μl up to 20 μl | 10 mM each |
8 mM | ||
- |
c. 帽子類似物與每種 NTP 的摩爾濃度之比應(yīng)為 4 : 5，該摩爾比適用于 CleanCap 系列帽子類似物。若使用其它結(jié)構(gòu)的帽子類似物，請根據(jù)帽子類似物的說明書設(shè)定帽子類似物與 GTP 的合理比例，可根據(jù)加帽效率調(diào)整比例，但兩者終濃度之和控制在 10 mM 為宜。
③非放射性標(biāo)記 RNA 體外轉(zhuǎn)錄體系
試劑 | 體積 | 終濃度 |
10× T7 Transcription Bu?er | 2 μl | 1× |
T7 Enzyme Mix | 2 μl | - |
Template DNA | 1 μg | 50 ng/μl |
ATP/CTP/GTP (100 mM each) | 2 μl each | 10 mM each |
UTP (100 mM) | 1.5 μl | 7.5 mM |
修飾 UTP (50 mM)d Nuclease-Free Water | 1 μl up to 20 μl | 2.5 mM |
- |
d. 本體系適用生wu素修飾 UTP、熒光素修飾 UTP、地gao辛修飾 UTP 或者氨基烯丙 基修飾 UTP，使用修飾 UTP 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量會比未修飾 UTP 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量偏低。
注 1：不同模板序列的轉(zhuǎn)錄效率差異較大，初次實驗可先按照建議加入量進行，然 后再摸索優(yōu)化最適體系，模板量可在 0.5 μg~2 μg的范圍進行調(diào)整。
（2）充分混勻并瞬離后，37℃溫育 2 h。若轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度 <100 nt，可 延長反應(yīng)時間至 3~16 h。
（3）反應(yīng)結(jié)束后，向產(chǎn)物中按照每 μg Template DNA 加入 2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育 15 min 以去除 DNA 模板。
（4）轉(zhuǎn)錄后的 RNA 推薦用磁珠或者柱純化，也可以采用酚/氯仿或者氯化鋰純化。純化后的 RNA 可以進行下游實驗或者儲存于 -80℃?zhèn)溆谩?/p>
3. 對照模板轉(zhuǎn)錄（T 包裝不含）
對照模板是一個含有T7啟動子的線性 DNA 片段，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小 約 4000 nt。在推薦的標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，1μg 對照模板 DNA 在 37℃下反應(yīng) 2h至少可獲得150μg以上的 RNA。
4. 產(chǎn)物純化
轉(zhuǎn)錄后的 RNA 可以選用磁珠法進行純化，也可以采用柱純化、酚 / 氯仿純化法或氯化鋰沉淀法等，以去除蛋白、游離的核苷酸。純化后的 RNA 經(jīng)電泳檢測后可進行下游實驗或存儲于 -80℃。
(1) 磁珠純化法
按照磁珠說明書進行純化操作。
(2) 柱純化法
純化前加入80μl Nuclease-Free Water 將產(chǎn)物稀釋至 100 μl，再按純化柱說明書進行純化操作。
(3) 酚 / 氯仿純化法
①向 20 μl 反應(yīng)混合物中，加入 115 μl Nuclease-Free Water 和 15 μl 3 M 乙酸鈉 (pH5.2)，混合均勻。
②加入等體積 (150 μl) 的酚 / 氯仿 (1：1) 混合液抽提一次，室溫以最大轉(zhuǎn) 速 (≥12000 rpm） 離心 5 min，將上層水相溶液轉(zhuǎn)移至新的 RNase-free EP 管中。
注：轉(zhuǎn)移上清時請勿吸到中間層。
③再加入等體積的氯仿抽提 2 次，收集上清，并轉(zhuǎn)移至新的 RNase-free EP 管中。
④加入 2 倍體積的無水乙醇沉淀 RNA?；旌暇鶆蚝笾糜?-20℃至少 30 min，以最大轉(zhuǎn)速(≥12000 rpm），4℃離心 15 min，收集沉淀。
⑤加入 500 μl 冰預(yù)冷的 70% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，以最大轉(zhuǎn)速 (≥12000 rpm） ， 4℃離心 5 min ，收集沉淀。
⑥用 20 μl Nuclease-Free Water溶解RNA 沉淀。純化后的 RNA 溶液于 -80℃保存。
(4) 氯化鋰沉淀法
采用氯化鋰沉淀法，RNA 長度至少滿足 100 nt 以上，且濃度不能低 于 100 ng/μl。
①向 20 μl 反應(yīng)混合物中，加入 30 μl Nuclease-Free Water 和 30 μl 7.5 M 氯化鋰。
②混合均勻后，置于 -20℃至少 30 min，以最大轉(zhuǎn)速 (≥12000 rpm），4℃ 離心 15 min，收集沉淀。
③加入 500 μl 冰預(yù)冷的 70% 乙醇洗滌 RNA 沉淀，以
最大轉(zhuǎn)速 (≥12000 rpm），4℃離心 5 min，收集沉淀。
④用 20 μl Nuclease-Free Water 溶解 RNA 沉淀。純化后的 RNA 溶液 于 -80℃保存。
5. RNA 定量
(1) 紫外吸收法：游離的 NTP 等會嚴重影響定量的準(zhǔn)確性，采用此方法 前請*行 RNA 純化。
(2) 染料法：可使用 RNA 特異熒光染料或相關(guān)試劑盒進行 RNA 定量，可 以對純化或者未純化的反應(yīng)產(chǎn)物中的 RNA 進行定量。
6. RNA 檢測
(1) 凝膠電泳法
為了評估轉(zhuǎn)錄本的長度及質(zhì)量，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物應(yīng)選擇合適的非變性或變 性瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測。變性電泳下可減少 RNA 的 二級結(jié)構(gòu)形成 , 通常 RNA 以正確大小的單個條帶遷移。
轉(zhuǎn)錄本長度 | 推薦使用電泳凝膠 |
>500 nt | 1% 瓊脂糖凝膠 |
100~500 nt | 2% 瓊脂糖凝膠或 4~5% 尿素變性聚丙烯酰胺凝膠 |
50~100 nt | 10%~15% 尿素變性聚丙烯酰胺凝膠 |
<50 nt | 20% 尿素變性聚丙烯酰胺凝膠 |
注 1：電泳緩沖液和凝膠均需現(xiàn)配現(xiàn)用，使用尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時推薦 用 0.5× TBE（貨號：T7272）電泳緩沖液電泳。
注 2：轉(zhuǎn)錄完成的 RNA 可用 Nuclease-Free Water 稀釋后電泳，電泳上樣量推薦 0.05~1 μg。
注 3：加完 RNA Loading Bu?er 后的樣品可于 65℃處理 5~10 min 以減少RNA二級結(jié)構(gòu)形成。
注 4：可使用 Safe Red 核酸染料 ( 貨號：CR001） 觀察 RNA 電泳條帶，聚丙烯 凝膠酰胺凝膠推薦用泡染法觀察條帶。
(2) 毛細管電泳法
毛細管電泳法可數(shù)字化的精確評估 RNA 樣本的完整性、純度或降解 程度。與凝膠法相比，此法所需 RNA 樣本量低，靈敏度高。
常見問題
問題描述 | 原因 | 解決方法 |
轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)量低 | 實驗?zāi)０逯锌赡苡幸种品磻?yīng)的組分或模板純度較差或模 板濃度不正確 | 若對照組產(chǎn)量正常，請重新純化模板并確定模板濃度及其特異性。 若對照組產(chǎn)量低，請咨詢本公司技術(shù)支持。 |
短片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)量低 | 轉(zhuǎn)錄起始片段短可能會抑制反應(yīng) | 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 100 nt 時，建議延長反應(yīng)時間或者增加模板量至 2 μg。 |
RNA 產(chǎn)物片段小于預(yù)期 | 模板序列中可能包含類似于 T7 RNA 聚合酶的終止序列 | 建議降低反應(yīng)溫度至 30℃可能會增加全長轉(zhuǎn)錄本的比例，但是產(chǎn)量會下降。 |
可能模板中 GC 含量高或形成二級結(jié)構(gòu) | 建議提高反應(yīng)溫度至 42℃或使用單鏈結(jié)合蛋白提高產(chǎn)量和長度。 | |
RNA 產(chǎn)物片段大于預(yù)期 | 質(zhì)粒模板 DNA 可能酶切不完quan | 建議質(zhì)粒模板 DNA 繼續(xù)進行酶切或者重新優(yōu)化質(zhì)粒模板 DNA 制備酶切反應(yīng)體系。 |
RNA 可能存在更強的二級結(jié)構(gòu)而未完quan變性 | 增加變性劑的濃度或加完 RNA Loading Bu?er 后樣品變性溫度可提高至 70℃。 | |
電泳拖尾 |
實驗過程可能污染 RNase | 建議單獨的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作區(qū)域、專用的 RNA 試劑及移液器；實驗過程中佩戴口罩 和手套，并經(jīng)常更換手套；使用 RNase-free 耗材；試劑不使用時請蓋好蓋子；反 應(yīng)過程中保證試管緊密封閉。 |
模板可能有 RNase 污染 | 模板存在 RNase 污染也可能造成 RNA 產(chǎn)物片段小于預(yù)期，建議重新純化模板 DNA 后用 Nuclease-Free Water 或 DEPC 處理水溶解。 |
010-60608020
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