一、準(zhǔn)備工作

 

　　開(kāi)始前，請(qǐng)確保以下材料和試劑已備齊：納米抗體偶聯(lián)beads、平衡緩沖液（如PBS，pH7.4）、洗脫緩沖液（如0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7）、中和液（如1MTris-HCl，pH8.5），以及待純化的樣品。建議將所有緩沖液提前過(guò)濾除雜，并置于4℃預(yù)冷。

 

　　二、操作步驟

 

　　1.beads平衡

 

　　取適量納米抗體beads（根據(jù)目標(biāo)蛋白量而定，一般1mLbeads可捕獲5-10mg蛋白）加入層析柱或離心管中。用5倍柱體積的平衡緩沖液清洗beads兩次，以去除存儲(chǔ)液中的防腐劑。輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩破壞beads結(jié)構(gòu)。

 

　　2.樣品孵育

 

　　將預(yù)處理好的樣品（建議離心澄清并用0.45μm濾膜過(guò)濾）加入到平衡后的beads中。室溫下旋轉(zhuǎn)孵育30-60分鐘，或4℃孵育2小時(shí)（對(duì)于易降解蛋白更友好）。孵育期間保持beads懸浮，確保納米抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。

 

　　3.洗滌去雜

 

　　孵育結(jié)束后，低速離心（500-1000g，1分鐘）或自然沉降beads，棄上清。用10倍柱體積的洗滌緩沖液（可含少量Tween-20，如0.05%）分3-4次洗滌beads，每次顛倒混勻后離心去上清。這一步可有效去除未結(jié)合的雜蛋白和非特異性吸附。

 

　　4.目標(biāo)蛋白洗脫

 

　　向洗凈的beads中加入1-2倍柱體積的洗脫緩沖液，輕柔混勻，室溫靜置5-10分鐘。離心收集上清液，并立即加入中和液（每1mL洗脫液加50-100μL中和液）調(diào)節(jié)pH至7.0左右，以保持蛋白活性。如需更高濃度，可重復(fù)洗脫一次，合并洗脫液。

 

　　5.beads再生與保存

 

　　使用過(guò)的beads可用再生緩沖液（如0.1M檸檬酸，pH3.0）清洗兩次，再用平衡緩沖液洗凈至中性，最后加入20%乙醇作為保護(hù)液，于4℃保存。通常可重復(fù)使用3-5次，結(jié)合能力無(wú)明顯下降。

 

　　三、注意事項(xiàng)

 

　　-整個(gè)操作盡量在冰上或冷室中進(jìn)行，以保護(hù)蛋白活性。

 

　　-洗脫后立即中和，避免蛋白長(zhǎng)時(shí)間處于酸性環(huán)境。

 

　　-若目標(biāo)蛋白洗脫效果不理想，可嘗試不同pH的洗脫液（如pH2.2-3.5）或競(jìng)爭(zhēng)性洗脫（如添加標(biāo)簽肽）。

 

　　-納米抗體beads對(duì)剪切力敏感，離心轉(zhuǎn)速不宜過(guò)高，移液時(shí)使用剪口槍頭。

 

　　四、方法優(yōu)勢(shì)

 

　　相比傳統(tǒng)ProteinA/G親和層析，納米抗體beads無(wú)需額外引入抗體標(biāo)簽，可直接識(shí)別天然構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。整個(gè)流程無(wú)需專(zhuān)用設(shè)備，普通離心管即可完成，從樣品到純化產(chǎn)物通常在2小時(shí)內(nèi)完成，回收率可達(dá)80%以上，純度滿(mǎn)足大多數(shù)下游應(yīng)用（如WB、ELISA、質(zhì)譜分析）。