G418 (Geneticin) 遺傳霉素

產(chǎn)品貨號(hào)：G4180

儲(chǔ)存溫度：常溫運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期 3 年。避免受潮，否則會(huì)降低抗生素活力。

產(chǎn)品描述

G418是一種結(jié)構(gòu)類似于慶da霉素 B1（Gentamycin B1）的氨基糖苷類抗生素，在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染zui常用的抗性篩選試劑，。它通過(guò)抑制轉(zhuǎn)座子 Tn601，Tn5 的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成， 對(duì)原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ,也包括 原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)。當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后 , ,則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，此酶通過(guò)共價(jià)修飾 G418 的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn)，需要建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）確定殺死無(wú)抗性細(xì)胞的最di有效濃度。植物細(xì)胞中，通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶 nptII 基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII 基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個(gè)酶使 得多種抗生素喪失活性，包括 G418，卡na霉素和ba龍霉素。

產(chǎn)品性質(zhì)

英文別名（English synonym）	Antibiotic G418; G418 Sulfate
中文別名（Chinese Synonym）	G418 硫酸鹽；遺傳霉素
CAS號(hào)（CAS NO.）	108321-42-2
分子式（Formula）	C20H40N4O10·2 H2SO4
分子量（Molecular weight）	692.7 g/mol
外觀（Appearance）	白色粉末
純度（Purity）	>700Ug/mg
溶解性（Solubility）	溶于水
結(jié)構(gòu)式（Structure）

使用方法

1. G418 儲(chǔ)存液的配制（50 mg/mL，活性濃度）

1）活力單位的換算 根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A0）×A1=A2，其中 A0是 G418 的

活力值（Potency），因批次而異?？梢?jiàn)批次對(duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告， 或者瓶子上的標(biāo)簽。A1 是想配制的活性 G418 濃度。A2 是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度。 比如若所用批次的 G418

活力值為：750 U/mg，要配制 50 mg/mL 的 G418 活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為 1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。 如果配制 10 mL 的 G418 儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/mL），則需要稱取 663.3 mg 粉末。

2）除菌和保存 根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量，加入 10 mL 無(wú)菌去離子水內(nèi)使其wan全溶解。 先用 5 mL 無(wú)菌去離子水預(yù)濕潤(rùn) 0.22 μm 針頭式過(guò)濾器，除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾，除菌后分裝成單次使用的小量（如 1mL）放到-20℃凍存，1 年穩(wěn)定。                                                                  

【注】①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過(guò)濾，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨磜an全溶解，過(guò)濾過(guò)程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性。 ②不建議使用液體培養(yǎng)基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來(lái)制備儲(chǔ)存液。

2. 常用篩選濃度

一般來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的 G418，并用一個(gè)較低濃度的 G418 用于維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件，細(xì)胞類型和其他 的環(huán)境因素都可能影響 G418 的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來(lái)確 定最佳篩選濃度。 通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍 200-2000 μg/mL；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL；

以下是一些細(xì)胞類型使用 G418 篩選使用的濃度，可做參考。

3.殺滅曲線的建立

【注】為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最di濃度，可通過(guò)建立殺滅曲 線（劑量反應(yīng)曲線）來(lái)實(shí)現(xiàn)，至少選擇 6 個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí) G418 的活性最qiang，因此在添加 G418 之前需 要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。

1）第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照 20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2 培養(yǎng)過(guò)夜；

【注】對(duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

2）根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定 0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。

3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4）接下來(lái)每 3-4 天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

5）按照固定的周期（如每 2 天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是 7-10 天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最di濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

1）轉(zhuǎn)染 48 h 后，用含有適當(dāng)濃度的 G418 篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

【注】細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果zui 好。則當(dāng)細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到j(luò)iao好的篩選效guo，最 好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò) 25%。

2）每隔 3-4 天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）篩選 7 天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞 類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4）挑取并轉(zhuǎn)移 5-10 個(gè)抗性克隆于 35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng) 7 天。

5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

注意事項(xiàng)

1）本品不可高壓滅菌；

2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如qing霉素/lian霉素）共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其他的抗生素也 會(huì)產(chǎn)生交叉活性。

3）配制G418溶液時(shí)，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來(lái)進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液以及工作液。

4）G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過(guò)低，或者細(xì)胞密度過(guò)高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。

5）即使加入殺死劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

6）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。