產品貨號：FA0050

儲存條件：2℃-8℃短期保存；于-20℃長期保存

1.產品介紹

Flag 標簽是一個由八個親水氨基酸組成的多肽片段，定位在融合蛋白表面，因此更易與抗體結合以及被腸激酶分解。DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads是以抗Flag(DYKDDDDK)納米抗體為親和配體，一步純化原核、酵母或哺乳動物細胞表達的Flag 標簽融合蛋白。

DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads以4%瓊脂糖凝膠為基質，雜蛋白非特異性結合少，可用于Flag標簽融合蛋白的純化和免疫沉淀（IP)。

2.試劑準備

2.1樣品準備

上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強度和pH值，可以用平衡液對樣品或細胞培養(yǎng)液稀釋，或者用平衡液透析。樣品在上樣前建議離心或用0.22 um或0.45 um濾膜過濾，減少雜質，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

2.2緩沖液的準備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 um 或0.45 um濾膜過濾。

平衡/洗雜液： 50 mM Tris，0.15 M NaCl，pH7.4

酸性洗脫液：0.1 M glycine HCl，pH3.0

競爭性洗脫液：50 mM Tris，0.15 M NaCl，100-500 ug flag多肽/ml，pH7.4

中和液：1 M Tris-HCl，pH8.0

3.樣品純化

3.1柱層析

1) 將DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads裝入合適的層析柱，層析用5倍柱體積的平衡液進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下。

2) 將樣品加到平衡好的DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads中，收集流出液，可以反復上樣增加結合效率。

3) 用10倍柱體積的洗雜液進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4) A酸性洗脫∶使用5倍柱體積的酸性洗脫液洗脫，收集管中預先加好中和液，加入量15-25 ul中和液/ml洗脫液，分管收集。

注：酸性洗脫后填料要立即用平衡液平衡，DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads在洗脫液中不要超過20 min。

B競爭性洗脫：使用5倍柱體積的競爭性洗脫液洗脫。分管收集。

5) 使用3倍柱體積的洗脫液再生，然后用平衡液平衡至中性。

6) 然后保存在含20%乙醇的PBS溶液中，2-8℃保存。

3.2靜態(tài)吸附

1）填料準備∶取適量DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads加入層析柱中，流干保護液。加入5倍柱體積的平衡液清洗。

2) 加入樣品溶液，4℃或室溫震蕩孵育至少30 min(不能磁力攪拌)，確保填料與樣品溶液充分混合。

3) 孵育完畢后，將填料混合液離心(5000×g 離心1 min)或過濾收集填料。

4) 將填料裝入層析柱中，用平衡液清洗直至紫外穩(wěn)定。

5) 用酸性洗脫液或競爭性洗脫液洗脫，參考3.1中4)。

6) 填料再生和保存參考3.1中5)和6)。

3.3免疫沉淀操作流程

1) 填料準備：取40ul的DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads (柱體積20 pl)混合液加入到2ml離心管中，5000xg離心1 min，吸棄上清。

2) 填料加入0.5 ml平衡液，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護蛋白的作用)，5000×g離心1 min，吸棄上清。重復一次。

3) 加入200-100 uI樣品裂解液到處理好的填料中，混合均勻，在室溫下置于翻轉混合儀輕輕翻轉離心管，促使樣品和填料充分接觸并吸附，室溫至少1 h。5000xg 離心 1 min，吸棄上清。

4) 洗雜：加入0.5 ml的洗雜液，懸浮填料，輕輕混勻，5000xg離心1 min，吸棄上清。再重復三次。確保去除非特異性吸附。

5) 樣品洗脫：可根據后期檢測的需要選擇不同的洗脫方法。

A：酸性洗脫

加入100ul酸性洗脫液，懸浮填料。室溫孵育5 min,5000xg離心1 min。小心取出上清,不要吸到填料，用中和液中和。洗脫樣品放置4℃,長時間放置-20℃保存。

B：競爭性洗脫

加入100ul競爭性洗脫液洗脫。室溫孵育30 min, 5000×g離心1 min。 小心取出上清，不要吸到填料。洗脫樣品放置4℃，長時間放置-20℃保存。

C：變性洗脫

含有SDS的樣品緩沖液可以使DYKDDDDK抗體變性，洗脫后的DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads沒辦法重復使用。

每管中加入20 ul 2× Loading Buffer，95℃加熱 5min。5000xg離心1 min，吸取上清SDS-PAGE電泳檢測。