2x示蹤型定量試劑盒

貨號：R0212

儲(chǔ)存條件：長期保存請于 -20℃避光保存，解凍后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個(gè)月，盡量避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品描述

2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型（示蹤型定量試劑盒）是SYBR Green l嵌合染料法專用 qPCR 試劑，為2x預(yù)混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時(shí)間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動(dòng) Tag DNA 聚合酶，配合精心優(yōu)化的 Buffer 體系以及 PCR 反應(yīng)促進(jìn)因子，特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高，可有效抑制非特異性擴(kuò)增，對寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的 qPCR結(jié)果。本品已含有通用校正染料，與絕大多數(shù) qPCR 設(shè)備兼容，不需要額外添加染料來校正儀器。

本品可利用不同染料混合后產(chǎn)生的變色效應(yīng)，追蹤移液過程，從而顯著減少移液錯(cuò)誤。2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型中包含藍(lán)色染料，10x Dilution Buffer 中包含黃色染料。當(dāng) 2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型(藍(lán)色)中加入了用 Dilution Buffer稀釋的模板(黃色)后會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色→綠色的變色效應(yīng)，從而可以根據(jù)液體顏色準(zhǔn)確判斷是否已加入模板。

使用方法：

1. 模板稀釋

使用過程中，如需要進(jìn)行移液追蹤，則根據(jù)下表選擇合適的方式提前添加 Dilution Buffer 至模板中，然后進(jìn)行 qPCR 檢測;如不需要進(jìn)行移液追蹤，則不使用 Dilution Buffer 即可。

建議的 qPCR 反應(yīng)體系

a. 通常推薦的引物終濃度為 0.2 μM，可在 0.1~1 μM 范圍內(nèi)調(diào)整；

b. 如使用 Dilution Buffer 進(jìn)行加樣追蹤，模板體積請勿超出2~5μl/20 μl reaction。

如果模板用量低于 2 μl/20 μl reaction，會(huì)造成顯色偏淡，影響追蹤效果；如果模板用量高于 5 μl/20 μl reaction，Dilution Buffer 中的成分可能會(huì)干擾 qPCR 反應(yīng)。不同種類 DNA 模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，以確定最佳的 DNA 模板添加量。

注：當(dāng)模板類型為未稀釋 cDNA 原液時(shí)，不論其是否包含 1× Dilution Buffer，使用體積均不應(yīng)超過 qPCR 反應(yīng)總體積的 1/10，即 2 μl/20 μl reaction。

3. qPCR 反應(yīng)程序（可根據(jù)機(jī)型適當(dāng)調(diào)整）

兩步法

三步法

a.根據(jù)引物的 Tm 值進(jìn)行退火&延伸(退火)溫度的設(shè)定;若擴(kuò)增片段在 200bp 以內(nèi)，退火 &延伸(延伸)時(shí)間可以設(shè)置為 15 s;此外，退火&延伸(延伸)時(shí)間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的 qPCR 儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時(shí)間自行調(diào)整。

4.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

① 引物濃度調(diào)整

當(dāng)引物終濃度在 0.1~1.0 μM 范圍之間變化時(shí)，引物濃度越低,擴(kuò)增特異性越高，但擴(kuò)增效率會(huì)有所下降。

② 擴(kuò)增程序優(yōu)化

需提高擴(kuò)增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高擴(kuò)增效率，可使用三步法程序或延長延伸時(shí)間。

5.引物設(shè)計(jì)原則

① 擴(kuò)增產(chǎn)物長度建議控制在 80~200 bp;

② 引物長度為 18~25 bp;

③ 兩條 Tm 值相差不超過 1℃，Tm 值控制在 58~62℃;

④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60%;

⑤ 引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避開 T/C 或者 A/G 的連續(xù)結(jié)構(gòu)(特別是 3' 端)，3' 端最后一個(gè)堿基最好為 G 或者 C;

⑥ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補(bǔ)序列;

⑦ 使用 NCBI BLAST功能檢索確認(rèn)引物的特異性。