噻唑蘭 MTT

產(chǎn)品貨號(hào)：0793-1

儲(chǔ)存條件：冰袋運(yùn)輸。4℃避光干燥保存。

產(chǎn)品描述

噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），也稱作溴化噻唑藍(lán)四氮唑，是一種黃色染料，已經(jīng)普遍替代傳統(tǒng)的臺(tái)盼藍(lán)染色法或者放射性同位素插入法，用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖以及細(xì)胞毒性分析。檢測(cè)原理在于：MTT是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷，具有細(xì)胞膜滲透性。活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠催M(jìn)入的MTT還原成為水不溶性的深藍(lán)色MTT-甲臜結(jié)晶，而死細(xì)胞不具有此功能。甲臜結(jié)晶是不能穿透細(xì)胞膜，因此沉積在處于增殖且未受損傷的細(xì)胞內(nèi)。甲臜結(jié)晶可用DMSO或者酸化的異丙醇溶解出來(lái)，酶標(biāo)儀下測(cè)定570nm的吸光度反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比，用以評(píng)估細(xì)胞存活狀況。

MTT也可用作免疫組化/細(xì)胞化學(xué)染色試劑，也可用來(lái)檢測(cè)NAD。MTT被快速還原成甲臜后，能夠螯合鎳，銅和鈷。鈷螯合物可參與機(jī)體氧化系統(tǒng)。

產(chǎn)品性質(zhì)

使用方法（以96孔板為例）

細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，因此進(jìn)行MTT檢測(cè)時(shí)需考慮這些條件，包括：培養(yǎng)時(shí)間，傳代次數(shù)以及生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分等。一般情況，48-72h培養(yǎng)時(shí)間下，最初鋪板的細(xì)胞密度可控制在5000-10,000/孔。

【注】

最終檢測(cè)的培養(yǎng)液內(nèi)含有酚紅會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。推薦MTT檢測(cè)時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)酚紅環(huán)境下。也可以在進(jìn)行MTT孵育的時(shí)候改用無(wú)酚紅培養(yǎng)液。

A．工作液配制

1）MTT溶液

生化研究中，常配制成5mg/mL的儲(chǔ)備液。MTT最hao現(xiàn)配現(xiàn)用，可以稱取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22 μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，4℃ 避光短時(shí)間保存。建議小劑量分裝放到-20℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。

2）SDS-HCl溶液（MTT終止液）

取10 mL 0.01 M HCl加入1 g SDS，顛倒混勻或者超聲使其*溶解，此時(shí)即為終止液。建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

B．MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)

1）接種細(xì)胞：用含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔5000-10, 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 µL，培養(yǎng)板的邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。設(shè)置空白對(duì)照孔（不含有細(xì)胞）。

2）37℃，5% CO2，培養(yǎng)24-72 h。

3）可選：對(duì)于貼壁細(xì)胞，去除舊的培養(yǎng)液，更換100 µL/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）；對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心96孔板，去除盡可能多的上清液。然后加入 100 µL/孔新鮮的培養(yǎng)液（不含酚紅）重懸細(xì)胞；

4）每孔加入10 µL MTT溶液（5 mg/mL），加樣時(shí)盡量勤換槍頭，控制加量誤差。

5）水平搖床上低速混勻1 min后，放入37℃培養(yǎng)箱孵育4h?！咀ⅰ浚簩?duì)于高密度的細(xì)胞（>100,000 cells/孔）可縮短孵育時(shí)間至2 h。

6）對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸掉舊的培養(yǎng)液，避免槍尖刮破單細(xì)胞層。對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)液。

7）加入100 µL/孔SDS-HCl溶液，用槍充分混勻后放入37℃培養(yǎng)箱孵育4 h?！咀ⅰ浚焊L(zhǎng)的孵育時(shí)間會(huì)降低檢測(cè)靈敏度。

8）孵育結(jié)束，放置在酶標(biāo)儀上搖勻后，選擇570 nm，測(cè)定吸光度。記錄結(jié)果，比色以空白調(diào)零。

【注】

對(duì)于細(xì)胞毒性檢測(cè)，以未經(jīng)藥物處理細(xì)胞的OD值為百分之bai，然后計(jì)算藥物處理細(xì)胞所占的比率（x），公式如下：OD（未處理細(xì)胞）/OD（藥物處理細(xì)胞）=百分之bai/x。然后建立直方圖。

注意事項(xiàng)

1）溶解甲臜的有機(jī)溶劑具有毒性，使用時(shí)注意防護(hù)。

2）MTT有致癌性，應(yīng)小心操作；MTT溶液需要無(wú)菌，因其對(duì)菌很敏感。MTT溶液不可4℃保存超過(guò)1周，因其可能發(fā)生降解，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤。

3）MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕dui數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度最hao在0-0.7范圍內(nèi)。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5）本產(chǎn)品僅作科研用途！